1、首先要拿到自己要設計引物的目的基因。這裏我使用一段GFP基因給大家講解。將目的基因儲存在txt文檔裏面，或者直接複製下來後在DNAMAN裏面新建文檔複製進去。下面是我們要設計引物的GFP基因序列。
2、開啟DNAMAN，選擇選單裏面的Primer-->Load Primer-->From Input。將上一步中的目的基因序列從開頭開始的20個左右的鹼基複製粘貼進去(引物長度要在15—30bp之間，常用的是18-27bp)，比如我們先試試前20個鹼基是否合適，將ATTGATGTGATATCTCCACT這20個鹼基複製粘貼進去，點擊OK。
3、再次點擊Primer，選擇Melting Temperature，開啟對話框。這裏面可以看到你的鹼基序列，個數以及Thermo，也即Tm值，是溶解溫度。Tm值一般在55℃到70℃之間比較好，PCR儀的退火溫度一般設定比primer的Tm低5℃（不過一般情況我們都設定爲55℃，因此Tm值在60左右比較好）。
4、從上圖可以看到我們這20個鹼基的Tm值只有49度，顯然太低，需要增加鹼基數量。我們取前24個鹼基粘貼進去，點擊下方Show Tm便可以看到這個引物的Tm值，發現是60.3度，很合適，就用這個了。這樣正向引物就設計完了，把這24個鹼基序列儲存下來。
5、設計反向引物需要將目的基因序列進行反向互補，然後按照正向引物一樣的方法設計便可。反向互補操作可以在DNAMAN裏面快速方便進行。開啟DNAMAN，選擇左側第一個Channel，然後點擊選單欄的Sequence-->Load Sequence-->From Sequence File…將我們儲存目的基因的txt文檔匯入到軟件中。【開啟txt文檔的時候記得在開啟視窗中的檔案類型裏面選擇All Files】
6、可以看到序列被匯入到了第一個Channel，雙擊這個Channel便可以看到我們的序列的詳細資訊。
7、保持Channel 1選中的狀態，選擇Sequence-->Display Sequence，開啟對話框。
8、選擇對話框中的Reverse Complement Seq，其他的複選框都取消。然後點擊OK。
9、這樣就可以看到目的基因的反向互補序列了。
10、對這個反向互補序列進行和上面設計正向序列引物一樣的操作，設計引物便可。具體的不再囉嗦，我直接把我的設計結果告訴大家：選擇前24個鹼基，也即TCAAAGATCTACCATGTACAGCTC，Tm值爲57.6，比較合適。到此引物設計就結束了。拿着剛纔設計的正向引物和這裏設計的反向引物就可以找公司幫我們合成引物了。
