原理爲: 將針對小分子抗原的抗體包被在酶標板上，檢測時加入待測樣本，使樣本中的待測抗原與酶標板上的抗體結合。然後加入HRP酶標記的抗原，此抗原也可與酶標板上的抗體結合，由於酶標板上固著的抗體數量有限，因此當樣本中抗原的量越多，則HRP酶標記抗原可結合的包被抗體就越少，兩種抗原競爭結合包被抗體，所以稱爲競爭法。
接着加入HRP酶的底物TMB，TMB被酶催化發生顏色反應，當樣本中抗原量越多，代表酶標板孔內留下的HRP標記抗原越少，顯色也就越淺。 夾心法又叫雙抗夾心法，用於檢測較大分子的抗原或抗體，又分爲:雙抗體夾心法，用於檢抗原和雙抗原夾心法用於檢抗體。
